摘要：目的探讨白芍总苷对自身免疫性甲状腺炎（autoimmunethyroiditis，AIT）大鼠肠道菌群及肠黏膜屏障的影响。方法SD大鼠随机分为对照组、模型组、硒酵母（36μg/kg）组及白芍总苷低、中、高剂量（、、mg/kg）组，每组8只。采用高碘水喂养联合sc猪甲状腺球蛋白与弗氏佐剂诱导AIT大鼠模型，造模后ig相应药物，1次/d，连续6周。采用ELISA法测定各组大鼠血清中甲状腺球蛋白抗体（thyroglobulinantibodies，TGAb）、甲状腺过氧化物酶抗体（thyroidperoxidaseantibodies，TPOAb）、肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）和白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）水平；采用苏木素-伊红（HE）染色观察各组大鼠甲状腺和结肠组织病理变化；采用透射电镜（TEM）观察各组大鼠结肠黏膜紧密连接结构；采用ELISA法测定各组大鼠结肠组织分泌型免疫球蛋白A（secretoryimmunoglobulinA，sIgA）水平；采用Westernblotting法检测各组大鼠结肠组织闭锁连接蛋白-1（zonulaoccludens-1，ZO-1）和闭合蛋白（Occludin）表达情况；采用16SrRNA高通量测序技术检测各组大鼠肠道菌群变化。结果白芍总苷能够显著降低AIT大鼠血清中TGAb、TPOAb和TNF-α水平（P＜0.），显著升高血清中IL-10水平（P＜0.），减轻甲状腺滤泡损伤及结肠黏膜病变程度，改善结肠黏膜紧密连接超微结构，显著升高结肠组织中sIgA水平（P＜0.05、0.01、0.），显著升高结肠组织ZO-1和Occludin蛋白表达水平（P＜0.01、0.），降低肠道菌群生物多样性及丰度指数，显著降低厚壁菌门相对丰度（P＜0.)，显著升高拟杆菌门相对丰度（P＜0.），显著升高乳酸杆菌属Lactobacillus、普雷沃氏菌属Prevotellaceae和罗姆布茨菌属Romboutsia相对丰度（P＜0.05、0.）。结论白芍总苷可能通过调节AIT大鼠肠道菌群组成及多样性，改善肠黏膜屏障损伤，从而发挥治疗AIT的作用。
自身免疫性甲状腺炎（autoimmunethyroiditis，AIT）又称桥本甲状腺炎，是最常见的自身免疫性甲状腺疾病。随着病情进展，20%～30%患者最终发展为甲状腺功能减退症，表现为畏寒、心动过缓、便秘、黏液性水肿等典型症状及体征[1]。AIT的病因与发病机制尚未完全阐明，传统观点认为其发病是遗传、环境、免疫等多因素共同作用的结果[2]。肠道是人体重要的消化及免疫器官，AIT患者肠道菌群物种组成发生改变且多样性增加[3-4]。肠黏膜屏障作为机体第一道防线，在免疫系统中发挥着重要作用。自身免疫性肝炎、糖尿病、炎症性肠病、慢性肾脏病等自身免疫性疾病均存在肠黏膜屏障损伤，损伤原因涉及细胞因子、肠道菌群、肠道免疫功能等多个方面[5]。研究发现AIT患者的十二指肠远端肠上皮细胞超微结构形态发生变化[6]。肠道菌群与肠黏膜屏障相互作用，共同维持着肠道稳态，一旦两者之间平衡被打破，可能诱发自身免疫性疾病[7]。
白芍总苷是白芍PaeonialactifloraPall.的主要有效成分，具有抗炎、镇痛、保护血管、护肝、调节免疫、抗抑郁、改善学习记忆等作用，常用于治疗类风湿性关节炎、银屑病、白塞病、过敏性紫癜、变应性鼻炎、强直性脊柱炎等自身免疫性疾病[8]。课题组前期研究发现，白芍总苷能够降低AIT大鼠甲状腺自身抗体水平，减轻甲状腺组织炎性反应，调节调节性T细胞（regulatoryTcell，Treg），从而起到治疗AIT的作用[9-10]。本研究探讨白芍总苷对AIT大鼠肠道菌群及肠黏膜屏障的影响，为其临床应用提供依据。1材料
1.1动物
SPF级雌性SD大鼠，6周龄，体质量（±10）g，购自三峡大学，动物许可证号SCXK（鄂）-2。动物饲养于湖北中医药大学实验动物中心，温度（23±2）℃、相对湿度（55±10）%、光照12h/d，自由进食饮水。动物实验经湖北中医药大学实验动物中心批准（批准号HUCMS）。1.2药品与试剂
白芍总苷胶囊（规格0.3g/粒，每克含芍药苷mg，批号H）购自宁波立华制药有限公司；硒酵母片（规格50μg/片，批号H）购自牡丹江灵泰药业有限公司；猪甲状腺球蛋白（批号）、完全弗氏佐剂（批号F）、不完全弗氏佐剂（批号F）购自美国Sigma公司；甲状腺过氧化物酶抗体（thyroidperoxidaseantibodies，TPOAb）ELISA试剂盒（批号Er）购自武汉华美生物工程有限公司；甲状腺球蛋白抗体（thyroglobulinantibodies，TGAb）ELISA试剂盒（批号R）购自南京森贝伽生物科技有限公司；肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、分泌型免疫球蛋白A（secretoryimmunoglobulinA，sIgA）ELISA试剂盒（批号分别为Rc、R6c、Rc）购自武汉伊莱瑞特生物公司；闭锁连接蛋白-1（zonulaoccludens-1，ZO-1）抗体（批号A）购自Abclonal公司；闭合蛋白（Occludin）抗体（批号-1-AP）购自武汉三鹰生物技术有限公司；β-actin抗体（批号BM）、山羊抗小鼠二抗（批号BA）、山羊抗兔二抗（批号BA）购自武汉博士德生物工程有限公司；DNA提取试剂盒购自美国Omega公司；TransStartFastpfuDNAPolymerase购自北京TransGen公司；DNA凝胶回收试剂盒购自美国Axygen公司。1.3仪器
H-W离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；Flexstation3多功能酶标仪（美国MD公司）；RM轮转式切片机（德国Leica公司）；DYCZ-40电转仪（北京六一仪器厂）；BX53型生物显微镜（日本Olympus公司）；HT-SS透射电镜（TEM，日本HITACHI公司）；NanoDrop分光光度计（美国赛默飞公司）；QuantStudio6PCR仪（美国ABI公司）；MiseqPE测序仪（美国Illumina公司）。2方法
2.1造模、分组与给药
大鼠适应性饲养1周后，随机选取8只作为对照组，其余大鼠采用猪甲状腺球蛋白与弗氏佐剂免疫注射联合高碘水喂养制备AIT大鼠模型[11]。第2～7周大鼠scμg猪甲状腺球蛋白，1次/周，进行2次初次免疫和4次加强免疫，同时给予碘化钠水（0.64g/L）喂养，建立AIT模型。造模大鼠随机分为模型组、硒酵母（36μg/kg，相当于临床等效剂量）组及白芍总苷低、中、高剂量（、、mg/kg，分别相当于临床等效剂量的1、2、4倍）组，每组8只[12]。硒酵母片研磨至极细粉末，溶于生理盐水配制成质量浓度为3.6μg/mL的混悬液；白芍总苷胶囊溶于生理盐水，分别配制成质量浓度为16、32、64mg/mL的溶液。自第7周开始，各给药组ig相应药物，对照组和模型组ig等体积生理盐水，1次/周，连续6周。2.2白芍总苷对AIT大鼠血清TGAb、TPOAb、TNF-α和IL-10水平的影响
给药结束后，大鼠禁食不禁水12h，ip10%水合氯醛麻醉后取血，离心取血清，按试剂盒说明书测定血清中TGAb、TPOAb、TNF-α和IL-10水平。2.3白芍总苷对AIT大鼠甲状腺和结肠病理变化的影响
大鼠取血完毕后，快速分离甲状腺和结肠组织，以生理盐水清洗，切成厚度为0.2～0.3cm的组织块，于4%多聚甲醛中固定24～48h，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋并制成厚度为4μm的切片，进行苏木素-伊红（HE）染色，于显微镜下观察并拍照。
2.4白芍总苷对AIT大鼠结肠黏膜紧密连接超微结构的影响
取各组结肠组织，于2.5%戊二醛中固定，用PBS缓冲液反复冲洗，于1%锇酸室温固定2h，常规梯度酒精脱水，丙酮渗透，环氧树脂包埋，60～80nm超薄切片，进行铀铅双染色，于TEM下观察结肠组织紧密连接、上皮微绒毛等超微结构并拍照。2.5白芍总苷对AIT大鼠结肠组织sIgA水平的影响
取各组结肠组织，剪碎后用匀浆机制备匀浆液，0r/min离心10min，取上清液，按试剂盒说明书测定结肠组织中sIgA水平。2.6白芍总苷对AIT大鼠结肠组织ZO-1和Occludin蛋白表达的影响
取各组结肠组织，剪碎后加入磷酸酶抑制剂，裂解后匀浆，4℃、1r/min离心5min，取上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度。蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，于脱脂牛奶中封闭2h，加入ZO-1和Occludin抗体（1∶0），4℃孵育过夜；TBST洗涤，加入山羊抗小鼠/兔二抗（1∶），37℃孵育2h；加入ECL发光液显影曝光，扫描胶片，采用BandScan软件分析。2.7粪便菌群DNA的提取及测序
每组随机选取5只大鼠，肛周消*后固定并将其尾部提起，手指按压下腹部促使排便，收集粪便2～3颗于灭菌冻存管。按试剂盒说明书进行微生物群落总DNA抽提，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，使用NanoDrop测定DNA质量浓度和纯度。使用扩增引物F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）对16SrRNAV3～4可变区进行PCR扩增，扩增程序：95℃预变性3min，27个循环（95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s），72℃稳定延伸10min，4℃保存。扩增结果用2%琼脂糖凝胶回收，利用DNA凝胶试剂盒对回收产物纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测，并对回收产物进行检测定量。使用NEXTFLEXRapidDNA-SeqKit建库，利用MiSeqPE平台进行高通量测序。利用生物信息学方法进行分类操作单元（operationaltaxonomicunits，OTUs）聚类（物种注释及丰度分析）、物种多样性、物种分类学组成等分析。2.8统计学方法
采用SPSS25.0软件进行数据分析，实验结果以表示，数据符合正态分布且方差齐。多组间比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），事后多重比较用LSD法。3结果
3.1白芍总苷对AIT大鼠血清中TGAb、TPOAb、TNF-α和IL-10水平的影响
如图1所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中TGAb、TPOAb和TNF-α水平均显著升高（P＜0.），IL-10水平明显降低（P＜0.）；与模型组比较，各给药组大鼠血清中TGAb、TPOAb、TNF-α水平均明显降低（P＜0.），IL-10水平均显著升高（P＜0.）。
3.2白芍总苷对AIT大鼠甲状腺和结肠组织病理变化的影响
如图2所示，对照组大鼠甲状腺滤泡结构完整，形态规则，呈类圆形，滤泡上皮细胞呈单层立方形，排列整齐，滤泡腔内充满胶质，滤泡间隙未见淋巴细胞浸润；模型组大鼠甲状腺滤泡上皮细胞呈扁平状，大部分滤泡结构破坏萎缩，可见淋巴细胞浸润；硒酵母组大鼠甲状腺滤泡上皮细胞排列整齐，滤泡腔萎缩，胶质含量减少，可见吸收空泡；白芍总苷各剂量组大鼠甲状腺滤泡结构完整性改善，淋巴细胞浸润明显减少，病变程度有所减轻。
对照组大鼠结肠黏膜完整，上皮细胞排列整齐，黏膜隐窝平行排列，杯状细胞丰富，无淋巴细胞浸润；模型组大鼠结肠黏膜上皮部分断裂、不完整，黏膜隐窝形态扭曲，伴有淋巴细胞浸润；各给药组结肠黏膜完整性有所恢复，淋巴细胞浸润明显减少。
3.3白芍总苷对AIT大鼠结肠黏膜紧密连接超微结构的影响
如图3所示，对照组大鼠结肠黏膜细胞间紧密连接结构完整，连接致密、连续，桥粒密度较高，上皮细胞表面微绒毛正常；模型组结肠黏膜细胞间紧密连接出现部分断裂，连接开放、疏松，桥粒密度下降，微绒毛数量减少，且排列较紊乱；各给药组结肠黏膜细胞间紧密连接的连续性均有不同程度恢复，连接更加紧密，肠上皮微绒毛数量增加，排列较模型组整齐。
3.4白芍总苷对AIT大鼠结肠组织中sIgA水平的影响
如图4所示，与对照组比较，模型组大鼠结肠组织中sIgA水平显著降低（P＜0.）；与模型组比较，各给药组大鼠结肠组织sIgA水平均显著升高（P＜0.05、0.01、0.）。
3.5白芍总苷对AIT大鼠结肠组织ZO-1和Occludin蛋白表达的影响
如图5所示，与对照组比较，模型组大鼠结肠组织中ZO-1和Occludin蛋白表达水平均显著降低（P＜0.）；与模型组比较，各给药组大鼠结肠组织ZO-1和Occludin蛋白表达水平明显升高（P＜0.01、0.）。
3.6白芍总苷对AIT大鼠肠道菌群的影响
3.6.1物种多样性分析本研究对大鼠粪便样品进行测序及分析后，共得到条有效序列。如图6所示，当Shannon指数达到3.5时，各样本稀释曲线趋向平坦，表明测序数据足够大，能够反映样本中绝大多数的微生物多样性信息。α多样性反映微生物群落的丰富度和多样性，如表1所示，与对照组相比，模型组大鼠肠道菌群OTUs、Shannon、Simpson、Chao和Ace指数均呈上升趋势；与模型组比较，硒酵母组大鼠肠道菌群OTUs、Shannon、Chao和Ace指数均呈升高趋势，白芍总苷中、高剂量组大鼠肠道菌群OTUs、Chao和Ace指数均显著降低（P＜0.05、0.）。表明AIT大鼠肠道菌群物种多样性增加、丰度升高，肠道菌群过度生长，白芍总苷能够降低大鼠肠道菌群多样性。
β多样性通过分析不同样本的物种多样性，探索不同组样本微生物群落的差异性。主坐标分析（principalcoordinatesanalysis，PCoA）是β多样性具有代表性的一种非约束性数据降维分析方法，样品间距离越近，表明物种组成结构越相似。如图7所示，对照组和模型组在PC1水平上明显分开，表明AIT大鼠肠道菌群组成结构较对照组有明显改变；各给药组在PC1水平上明显偏离模型组，表明各给药组大鼠肠道菌群组成结构发生明显变化。3.6.2群落结构组成分析如图8所示，在门水平上，各组大鼠肠道菌群主要包括厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门等，对照组大鼠肠道菌群中厚壁菌门、拟杆菌门为优势菌门。与对照组相比，模型组厚壁菌门相对丰度显著升高（P＜0.），拟杆菌门相对丰度显著降低（P＜0.），厚壁菌门与拟杆菌门比值（F/B）显著升高（P＜0.）；与模型组比较，各给药组厚壁菌门相对丰度显著降低（P＜0.)，拟杆菌门相对丰度明显升高（P＜0.），F/B显著降低（P＜0.）。
如图9所示，在属水平上，各组大鼠肠道菌群主要包括Muribaculaceae、毛螺菌属Lachnospiraceae、瘤胃球菌属Ruminococcaceae、拟杆菌属Bacteroides、乳酸杆菌属Lactobacillus、罗姆布茨菌属Romboutsia、Turicibacter、普雷沃氏菌属Prevotellaceae、克里斯滕森菌属Christensenellaceae等，其中乳酸杆菌属、普雷沃氏菌属与罗姆布茨菌属组间变化明显。与对照组相比，模型组乳酸杆菌属、普雷沃氏菌属和罗姆布茨菌属相对丰度显著降低（P＜0.）；与模型组相比，硒酵母组及白芍总苷低、高剂量组乳酸杆菌属、普雷沃氏菌属和罗姆布茨菌属相对丰度均明显增加（P＜0.05、0.），白芍总苷中剂量组罗姆布茨菌属相对丰度显著升高（P＜0.）。4讨论
本研究采用高碘水喂养联合异原性抗原免疫法复制AIT大鼠模型，模型组大鼠血清TGAb和TPOAb水平显著升高，且甲状腺组织滤泡结构破坏，表明造模成功。补硒治疗可以有效降低血清TPOAb水平，由于硒酵母安全性高、临床使用范围广，本研究将其作为阳性对照药物[9]。结果显示，白芍总苷显著降低AIT大鼠血清TGAb和TPOAb水平，改善甲状腺组织病理形态，与前期研究结果基本一致[9]；白芍总苷显著降低血清中促炎细胞因子TNF-α水平，升高抗炎细胞因子IL-10水平，纠正炎性反应稳态失衡；白芍总苷能够调节AIT大鼠肠道菌群组成，升高结肠组织sIgA、ZO-1和Occludin蛋白表达水平，改善结肠黏膜屏障中肠上皮结构及紧密连接超微结构。多种自身免疫性疾病中肠道菌群组成与功能均发生变化，肠道菌群紊乱可加重免疫发病进程[13]，疾病进展又可反向加剧肠道菌群紊乱程度[14]。甲状腺外周稳态对微生物变化敏感，自身免疫性甲状腺疾病的发生发展可能受到肠道菌群组成变化的影响[15]。厚壁菌和拟杆菌占肠道菌群的90%以上，是哺乳动物的优势菌群[16]。F/B与某些病理状况相关，被认为是肠道菌群健康的重要指标[17]。本研究发现AIT大鼠肠道厚壁菌门相对丰度显著升高，拟杆菌门相对丰度降低，F/B上升，表明AIT大鼠肠道菌群门水平物种比例失调，菌群呈紊乱态势，与文献报道一致[3]；白芍总苷组大鼠肠道厚壁菌门相对丰度降低，拟杆菌门相对丰度升高，F/B水平降低，门水平菌群紊乱被纠正。在属水平上，乳酸杆菌属、普雷沃氏菌属和罗姆布茨菌属相对丰度均下降，与AIT患者肠道菌群分析结果一致[4]。乳酸杆菌是益生菌的重要来源，能够通过分泌乳酸、过氧化氢、细菌素等物质降低肠道pH，具有杀菌或抑制病原菌黏附、感染的作用[18]。乳酸杆菌能够降低TNF-α水平，提高IL-10水平，并参与调节sIgA的分泌[19-20]。普雷沃氏菌具有定殖性和低致病性，在哮喘、慢性阻塞性肺疾病中相对丰度较低[21]；普雷沃氏菌能够利用富含纤维的碳水化合物产生短链脂肪酸，从而发挥抗炎作用[22]。白芍总苷低剂量组大鼠肠道乳酸杆菌属相对丰度增加，但乳酸杆菌属对中、高剂量白芍总苷反应不敏感，可能由于随着肠道中药物的积累，肠道菌群生长受到抑制，导致菌群多样性及相对丰度下降。肠黏膜屏障主要由机械屏障、免疫屏障、微生物屏障和化学屏障构成[23]，是抵抗有害病原体的第一道防线，对维持机体内环境的稳定起着重要作用[24]。机械屏障由肠黏膜上皮细胞、紧密连接等组成，其中紧密连接是维持肠黏膜机械屏障功能完整的重要结构[25]。紧密连接蛋白主要包括以Occludin为代表的跨膜蛋白和以ZO-1为代表的胞浆蛋白，Occludin胞间两两相连形成吻合结构而封闭细胞间隙，ZO-1与前者相互连接，使紧密连接形成网状结构而更加稳定。sIgA是肠黏膜免疫屏障的重要组成部分，与体液及细胞免疫共同发挥局部免疫功能[26]，具有增强肠道免疫、阻止条件致病菌增殖及病原菌入侵、恢复肠道微生态平衡的作用[27]。本研究结果显示，AIT大鼠结肠组织sIgA、ZO-1和Occludin蛋白表达水平显著降低，结肠黏膜紧密连接超微结构部分断裂伴不连续，表明紧密连接完整性受损，肠黏膜屏障功能失常；白芍总苷组大鼠结肠组织sIgA、ZO-1和Occludin蛋白表达水平上调，结肠黏膜紧密连接超微结构有不同程度恢复，表明肠黏膜屏障功能损伤得到改善。肠道菌群中的正常菌群依靠定殖能力紧密黏附在肠黏膜上，构成了肠道的微生物屏障[28]。肠道菌群紊乱可直接损伤微生物屏障，稳态失衡的肠道菌群进而引起一系列复杂的病理反应。同时，肠道菌群的组成受到黏膜免疫系统的监视，细胞间紧密连接功能的强弱又可通过影响肠黏膜通透性决定菌群抗原是否暴露，肠道菌群、紧密连接、肠黏膜免疫屏障之间的相互协调作用有助于维持肠道稳态[29]。此外，短链脂肪酸、胆汁酸、吲哚等各类肠道菌群代谢产物在免疫调节和疾病发生中有着不可忽视的作用[30]，因此，肠道菌群代谢产物的变化有待进一步研究。
综上所述，白芍总苷能够降低AIT大鼠甲状腺自身抗体水平，调控炎性因子及sIgA，减轻甲状腺滤泡损伤及结肠黏膜病变程度，改善结肠紧密连接超微结构，增加结肠紧密连接蛋白表达水平，调节肠道菌群生物多样性及物种组成，改善肠黏膜屏障损伤，从而起到治疗AIT的作用。课题组后续将深入探究乳杆菌等肠道优势菌对AIT大鼠甲状腺自身抗体、细胞因子、肠黏膜屏障损伤的作用。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来源：牧亚峰，向楠，左新河，余欣然，赵勇，陈继东．白芍总苷对自身免疫性甲状腺炎大鼠肠黏膜屏障及肠道菌群的影响[J].中草药,,52(11):-.
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